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Pgcl perdita di grasso

Carcinoma polmonare non a piccole cellule Prognosi Terapie mirate Astratto L'autofagia svolge una funzione critica nella patogenesi, nella risposta alla terapia e nei risultati clinici nei tumori. Sebbene un recente rapporto abbia mostrato un ruolo dell'iASPP nella soppressione dell'autofagia, la sua potenziale attività come regolatore dell'autofagia pgcl perdita di grasso è stata studiata nel carcinoma polmonare.

Qui abbiamo studiato la potenziale funzione e il meccanismo molecolare di iASPP nel mediare l'autofagia nel carcinoma polmonare umano non a piccole cellule.

I nostri dati hanno suggerito che l'espressione forzata di pgcl perdita di grasso ha innescato il flusso autofagico, mentre l'inibizione di iASPP ha soppresso l'autofagia nella fase di formazione dell'autofago in vitro. Infine, l'espressione citoplasmatica di iASPP è stata sovraregolata nei pazienti con carcinoma polmonare ed è stata identificata come un cattivo fattore prognostico indipendente per la morte specifica del carcinoma polmonare nei campioni dei pazienti.

Nel loro insieme, i nostri dati hanno mostrato che iASPP usando gli ultrasuoni per perdere peso promuovere la crescita tumorale aumentando il flusso autofagico e che iASPP potrebbe servire da cattivo fattore prognostico e potenziale bersaglio terapeutico nel carcinoma polmonare.

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La proteina che stimola l'apoptosi della famiglia p53 ASPP stimola la funzione apoptotica della p53 in seguito a danni al DNA e funge da soppressore del tumore. Un'alta espressione di iASPP è stata identificata per facilitare la progressione del carcinoma prostatico, 4 resistono alla chemioradioterapia 5 ed essere associata a peggioramento della malattia e scarsa sopravvivenza.

Come segno distintivo emergente del cancro, l'autofagia aberrante, svolge una funzione critica nella patogenesi, esito e risposta alla terapia in numerosi tumori. Qui abbiamo esplorato il ruolo di iASPP nel carcinoma polmonare. Abbiamo dimostrato che l'espressione di iASPP era importante per la modulazione del processo metabolico autofagico nelle cellule tumorali polmonari. Inoltre, silenziare l'espressione di iASPP potrebbe non solo promuovere la segnalazione apoptotica, ma anche prevenire l'autofagia attivando il bersaglio dei mammiferi della rapamicina mTOR e promuovendo la formazione di autofagosomi.

L'autofagia ha effetti pro o anti-sopravvivenza sulle cellule tumorali a seconda del tipo o del contesto del tumore. Per valutare se l'autofagia è stata indotta da iASPP nelle cellule tumorali polmonari, abbiamo analizzato la localizzazione e la distribuzione di LC3 endogeno nelle cellule tumorali polmonari mediante immunofluorescenza.

Abbiamo trovato un aumento dei punti LC3, una misura per l'autofagia, nelle cellule H sovraespresse di iASPP rispetto al modello diffuso nelle cellule di controllo Figure 1a e b, a sinistra. Inoltre, abbiamo monitorato l'alterazione del flusso autofago mediata dalla sovraespressione di iASPP utilizzando il test del flusso LC3 basato sull'immunoblot.

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È stato analizzato il livello di espressione di LC3-II la forma spaccata e lipidata della catena leggera 1 della proteina 1 associata ai microtubuliun marker iniziale per la formazione di autofagosomi. GAPDH era un controllo di caricamento. Lo studio di immunofluorescenza ha mostrato che il knockdown di iASPP ha portato a una diminuzione dei punti LC3 rispetto alle cellule di scramble Figure 2a e b, a sinistra.

Questi risultati hanno suggerito che il knockdown di iASPP ha compromesso l'autofagia cellulare nelle cellule A e H Il knockdown dell'iASPP compromette l'autofagia cellulare sopprimendo lo stadio della formazione dell'autofagosoma nelle cellule A Il valore nelle cellule di controllo dello scramble senza alcun trattamento è stato normalizzato come 1.

Il valore medio nelle cellule trasfettate con il vettore di scramble è stato normalizzato come 1.

I nuclei sono stati colorati con H Inoltre, abbiamo valutato il livello proteico dei geni associati all'autofagia Atg mediante western blot. Rispetto alle cellule di controllo trattate con EBSS, il livello proteico di Atg12 — Atg5 coniugato, essenziale per la formazione di autofagosomi, è stato anche ridotto nelle cellule silenziate iASPP trattate con EBSS Figura 2g, corsia 4 contro corsia 3 e 2h, a destra.

Collettivamente, questi risultati hanno indicato che iASPP potrebbe regolare l'autofagia nella fase di formazione dell'autofagosoma. Per determinare ulteriormente se mTOR, il principale regolatore negativo, abbia contribuito all'inibizione dell'autofagia nelle cellule silenzianti iASPP, abbiamo eseguito un esperimento di salvataggio e abbiamo inibito il percorso mTOR usando rapamicina, un inibitore mTOR. Inoltre, abbiamo dimostrato in precedenza che l'abbattimento dell'espressione di iASPP ha comportato una riduzione della proliferazione cellulare e la formazione di colonie in cellule di carcinoma polmonare in vitro, e qui abbiamo scoperto che la rapamicina ha anche ripristinato l'effetto anti-vitalità di shiASPP in modo dose-dipendente a 48 ore Figura 3f.

Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che l'inibizione dell'autofagia derivante dal silenziamento di iASPP dipende principalmente dall'attivazione di mTOR.

Il valore nelle cellule di controllo dello scramble con trattamento con rapamicina è stato normalizzato come 1.

L'analisi Western blot ha confermato che l'iASPP era notevolmente sovraespresso nelle cellule H Figura 1c, corsia 2 contro corsia 1. Il test di formazione di sferoidi, ampiamente utilizzato per rilevare cellule che iniziano il tumore, è stato eseguito per studiare ulteriormente l'effetto di iASPP sulla capacità di auto-rinnovamento in vitro. Per determinare se l'aumento del volume del tumore fosse una conseguenza di una maggiore proliferazione o di una ridotta apoptosi, abbiamo misurato l'antigene nucleare PCNA proliferante delle cellule, un marker di proliferazione cellulare mediante immunocolorazione, e rilevato l'apoptosi con deossinucleotidil transferasi terminale in situ TdT - etichettatura dUTP nick-end colorazione TUNEL nello xenotrapianto tumorale.

Come mostrato nelle Figure 4g e h, l'espressione di PCNA nel tumore iniziata da cellule che sovraesprimono iASPP è stata notevolmente aumentata rispetto al tumore formato da cellule strapazzate Figura 4g, pannello superiore; e Figura 4h, a sinistra.

Allo stesso tempo, c'erano meno cellule apoptosiche nei tumori iASPP rispetto ai tumori di controllo Figura 4g, pannello in basso; e Figura 4h, a destra.

Questi dati hanno suggerito che la sovraespressione di iASPP favorisce pgcl perdita di grasso crescita tumorale attraverso un aumento della proliferazione cellulare e una ridotta apoptosi cellulare. GAPDH è stato usato come controllo di caricamento.

La quantificazione della Western blot stimata come rapporto relativo di ciascuna proteina rispetto al GAPDH è stata mostrata sotto singole macchie Immagine a dimensione intera D'altra parte, per confermare ulteriormente i nostri risultati, abbiamo anche valutato l'effetto dell'inibizione di iASPP sulla crescita tumorale.

Inoltre, abbiamo rilevato l'influenza di iASPP sul livello di espressione di fattori di trascrizione cruciali nel mantenimento di auto-rinnovamento e pluripotenza nelle cellule staminali, tra cui OCT4, Nanog e SOX2. Coerentemente, il livello di espressione di questi fattori di trascrizione nelle cellule knockdown iASPP era significativamente ridotto Figure 4n e o.

L'aumentata espressione citoplasmatica di iASPP nei campioni di carcinoma polmonare è associata a uno scarso risultato clinico. L'analisi di sopravvivenza univariata di Kaplan-Meier ha rivelato che un aumento dell'espressione citoplasmatica di iASPP era associato ad un aumentato rischio di morte specifica per cancro al polmone in pazienti sottoposti a chirurgia radicale Figura 5b.

Questi risultati suggeriscono che una maggiore espressione dell'iASPP citoplasmatico ha un significato clinico conferendo un aumentato rischio di morte specifica per cancro al polmone. Tabella a grandezza naturale Pgcl perdita di grasso iASPP è un membro inibitorio della famiglia ASPP, che è stato segnalato come sovraespresso come oncogene in diversi tumori, come il carcinoma mammario e il carcinoma epatocellulare.

Inoltre, per la prima volta abbiamo dimostrato che iASPP potrebbe regolare l'autofagia cellulare nelle cellule tumorali polmonari. L'autofagia, un processo catabolico altamente conservato che comporta la consegna di componenti citoplasmatici ai lisosomi per la degradazione, ha un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'ambiente cellulare.

Il ruolo dell'autofagia nel cancro è stato controverso. Pgcl perdita di grasso stato dimostrato che i cheratinociti silenziati da iASPP hanno mostrato l'attivazione dell'autofago e la protezione dall'apoptosi.

Sembra che la funzione di iASPP nelle cellule non trasformate come i cheratinociti e le colture primarie di linfociti e fibroblasti sia totalmente opposta a quella delle cellule tumorali. L'autofagia ha funzioni dipendenti dal contesto in diversi stadi del cancro.

Come via soppressore, l'autofagia impedisce l'inizio del tumore; ma come via di sopravvivenza, l'autofagia contribuisce alla crescita e alla progressione del tumore attenuando lo stress metabolico cellulare e resistendo alla morte cellulare indotta da agenti terapeutici.

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Ad oggi, mTORC1 è il regolatore meglio caratterizzato dell'autofagia. È stato dimostrato che la rapamicina e i suoi analoghi potrebbero inibire l'attività di mTORC1.

Il trattamento con rapamicina potrebbe salvare l'attivazione di mTOR e almeno parzialmente resistere all'effetto anti-autofagia e anti-proliferazione nelle cellule shiASPP.

L'autofagia e l'apoptosi hanno ruoli significativi nel metabolismo cellulare e nella sopravvivenza.

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Tuttavia, l'interazione tra questi due processi è ancora lungi dall'essere completamente compresa. Zhou et al. Inoltre, livelli aumentati di caspase-3 attivato, un enzima cruciale nel processo apoptotico e scissione PARP da parte delle caspasi, un marker di morte cellulare apoptotica, 21 sono stati entrambi identificati nelle cellule di silenziamento iASPP, rispetto alle cellule di controllo Figura supplementare S1D. Inoltre, abbiamo dimostrato che iASPP potrebbe attivare OCT4, Nanog e SOX2, che sono fattori cruciali di trascrizione nel mantenimento del rinnovamento di sé e della pluripotenza nelle cellule staminali.

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Per quanto ne sappiamo, questo è il primo rapporto che iASPP potrebbe attivare l'espressione di questi marcatori di cellule staminali. Questi dati sono in linea con i rapporti secondo cui l'autofagia contribuisce all'arricchimento e alla sopravvivenza delle cellule staminali tumorali.

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L'attivazione dell'autofagia è un segno distintivo nelle cellule tumorali trattate con chemioterapia. L'autofagia è un meccanismo protettivo delle cellule tumorali indotto dallo stress per evitare una bassa nutrizione, radiazioni ionizzanti e chemioterapia. Ren et al 27 hanno scoperto che la sovraregolazione dell'autofagia ha avuto un ruolo importante nella resistenza al cisplatino dell'adenocarcinoma polmonare. Inoltre, abbiamo scoperto che la sovraespressione di iASPP ha indotto livelli più alti di espressione dei fattori di trascrizione correlati alle cellule staminali, suggerendo che iASPP potrebbe avere un ruolo importante nella resistenza alla chemioterapia delle cellule tumorali pgcl perdita di grasso, che potrebbe almeno in parte spiegare la sua associazione con una prognosi sfavorevole.

In sintesi, i nostri risultati mostrano che iASPP induce l'autofagia e facilita la crescita tumorale nel carcinoma polmonare. È stato ottenuto un consenso scritto e informato preliminare da tutti i pazienti o dalle loro famiglie.

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Lo studio è stato approvato dal Comitato etico e di ricerca del Cancer Hospital di Pechino University. Le caratteristiche clinicopatologiche dei tumori sono state definite in base al sistema di stadiazione tumore-nodo-metastasi dell'Unione per il controllo internazionale del cancro Tabella supplementare S1. Come controllo di qualità, abbiamo eseguito l'analisi di sopravvivenza Kaplan-Meier bruciagrassi untuk perut base allo stato di metastasi dei linfonodi o al trombo tumorale, che è comunemente considerato associato alla sopravvivenza dei pazienti con carcinoma polmonare.

Come mostrato nella Figura supplementare S1E, la sopravvivenza mediana dei pazienti con metastasi linfonodali o trombo tumorale era significativamente più breve di quelli senza metastasi linfonodali o trombo tumorale.

Il cDNA di primo filamento è stato sintetizzato dall'RNA totale usando primer oligodT 15 usando la trascrittasi inversa del virus della pgcl perdita di grasso murina moloney Invitrogen.

L'espressione del gene bersaglio è stata normalizzata a quella della gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi GAPDH. Le sequenze di primer sono state elencate nella Tabella Supplementare S2. I vettori della navetta lentivirale sono stati trasfettati in cellule T insieme ai plasmidi di aiuto lentivirali pHelper1. Tutti i plasmidi sono stati confermati dal sequenziamento. Induzione e inibizione dell'autofagia L'autofagia cellulare è stata indotta dalla privazione dei nutrienti attraverso l'incubazione nell'EBSS Sigma, St.

Immunoistochimica e colorazione TUNEL Le sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina sono state deparaffinate e reidratate usando alcoli classificati. Il recupero dell'antigene è stato eseguito utilizzando tamponi di acido citrico bollenti.

Le sezioni sono state disidratate e fotografate con lo scanner Aperio Versa Leica, Welzler, Germania. Per l'analisi della proliferazione, è stata calcolata la percentuale di cellule positive per PCNA. La fluorescenza è stata fotografata al microscopio Leica ed è stata determinata la percentuale di cellule positive al TUNEL. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalle linee guida istituzionali del comitato per la cura degli animali dell'ospedale per il cancro dell'Università di Pechino.

Il numero di punti LC3 per cella e la percentuale di strutture GFP-DFCP1 ingrandite sono stati conteggiati in pgcl perdita di grasso campi non sovrapposti in tre esperimenti indipendenti.

In caso contrario, i dati sono stati analizzati utilizzando i metodi indicati nel testo. Un valore P bilaterale di 0, 05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutti i dati statistici sono stati eseguiti da SPSS Informazione supplementare.